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體外細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟(1)凍存和復(fù)蘇

發(fā)布日期: 2019-11-12
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一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng);當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要做再培養(yǎng), 即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后,從一個(gè)容器以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng),為傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高 細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方 法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

二、實(shí)驗(yàn)方法

材料:

小鼠,生理鹽水,100ml滅菌燒杯,15ml離心管,培養(yǎng)皿,滴管,無(wú)菌鑷子、剪刀,篩網(wǎng),泡沫板,大頭針,酒精燈,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng) 液,PBS,0.25%胰酶,超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡,顯微鏡,計(jì)數(shù)板,離心機(jī),恒溫水浴箱,冰箱(4℃、-20℃、-70℃),液氮 罐,凍存管,凍存液,廢液缸等。

方法:

(1)原代培養(yǎng):

1.取出小鼠后瀝干酒精,放入超凈臺(tái)內(nèi),固定在泡沫板上。

2.用鑷子提起皮膚,用解剖剪剪開(kāi)皮膚一個(gè)橫切口,將皮膚向上撕開(kāi),然后剪開(kāi)肌肉等,暴露出腹腔,在左側(cè)找到脾臟,用彎頭眼科鑷取出脾臟,置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,并剔除多余無(wú)用的組織。

4.將篩網(wǎng)置于平皿中,脾臟置于篩網(wǎng)上,用彎頭鑷鑷住,輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨,同時(shí)不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。

5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中,離心(1000rpm,5min),吸去上清(去除血液等)。

6.加入10ml培養(yǎng)液,吹打混勻,取樣計(jì)數(shù)。

7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中,輕輕搖晃混勻,在培養(yǎng)瓶上。

面做好標(biāo)志,注明細(xì)胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)傳代培養(yǎng):

1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),確定細(xì)胞是否需要傳代。

2.培養(yǎng)液瓶打開(kāi)后,過(guò)酒精燈火焰,置酒精燈火焰周圍。

3.拿出直頭滴管,套上橡皮吸頭,過(guò)火,放入培養(yǎng)液瓶中。

4.打開(kāi)培養(yǎng)瓶,瓶口過(guò)火,將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸,用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。

5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,用量以薄薄蓋滿一層為宜,37℃消化,倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫離胰酶,然后將胰酶倒掉,加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基。

6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫壁并分散,再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,制成細(xì)胞懸液,然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋,適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn),以利于CO2氣體的進(jìn)入,將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

7.對(duì)半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,不需胰酶,直接吹打,加入新鮮培養(yǎng)基,然后分裝到各瓶中。

(3)凍存:

1.吸取傳代后的細(xì)胞懸液,離心,去除培養(yǎng)液,加入凍存液,分裝凍存管(凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為(5~10)×106個(gè)/ml,2ml凍存管中一般放1~1.5ml細(xì)胞)。

2.按步凍存

o冷凍保存方法一:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),可增至-5~-10℃/min;到-100℃時(shí),則可迅速浸入液氮中。

o冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1~3℃至-80℃以下,再放入液氮長(zhǎng)期保存。

(4)復(fù)蘇:

1.取出冷凍管,立即放入37℃水浴箱中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.打開(kāi)凍存管,將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。

4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng),第二天觀察生長(zhǎng)情況。

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