細(xì)胞凍存是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中細(xì)胞進(jìn)行保種并長(zhǎng)期保存的常用方法,其中細(xì)胞凍存液,作為細(xì)胞凍存時(shí)必須使用的一種溶液,不僅僅是說(shuō)只是用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞的保存,在細(xì)胞的購(gòu)買(mǎi)、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用,因此選擇一款好的細(xì)胞凍存液就尤為重要。
無(wú)血清細(xì)胞凍存液是指不含血清和動(dòng)物源成分的細(xì)胞凍存液,對(duì)比傳統(tǒng)細(xì)胞凍存液存在的優(yōu)勢(shì):
1.是一種通用型的細(xì)胞凍存液,可用于凍存人和各種動(dòng)物細(xì)胞株;
2.凍存液配方,即開(kāi)即用,方便快捷;
3.非程序降溫,-80℃低溫冰箱長(zhǎng)期凍存,也可液氮凍存;
4.特別配方(主要成分為DMSO和氨基酸)具有有效提高細(xì)胞凍存活率和復(fù)蘇活力;
5.不含動(dòng)物來(lái)源性蛋白,能減少各類(lèi)病毒、霉菌和支原體等的污染,確保凍存細(xì)胞安全;
6.可孔板(細(xì)胞培養(yǎng)板)凍存,可用于雜交瘤細(xì)胞的凍存液.
無(wú)血清細(xì)胞凍存液操作步驟,簡(jiǎn)單、方便:
一、細(xì)胞冷凍保存方法:
選擇凍存處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞有助于提高復(fù)蘇細(xì)胞存活率。
凍存管凍存方式:
1、按照常用方法收集懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞于試管中。
2、按照培養(yǎng)細(xì)胞密度和所用細(xì)胞凍存管的尺寸計(jì)算所需凍存細(xì)胞數(shù)。(參考:5×105至5×106 cells/ml)。
3、取相當(dāng)于所需細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮液量,置于離心管中,離心收集培養(yǎng)細(xì)胞(參考離心條件:1,000~2,000 rpm,4℃,3~5 min)。移去離心管中的上清液。
4、加入適量無(wú)血清細(xì)胞凍存液于離心管中,使細(xì)胞濃度為5×105至5×106 cells/ml。緩慢混合均勻,制成細(xì)胞混合液。
5、將離心管中的細(xì)胞混合液分裝于已標(biāo)示的冷凍保存管中。
6、直接將含細(xì)胞懸液的凍存管放入-80℃冰箱,冷凍保存。
7、若研究者需要液氮保存時(shí),可先放入-80℃冰箱過(guò)夜后,再移至-196℃液氮罐。
原位凍存方式:
1、從培養(yǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)板中將培養(yǎng)基上清吸取干凈。
2、加入適量無(wú)血清細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)孔板中,充分浸潤(rùn)細(xì)胞。
3、蓋上蓋板,做好密封措施,防止染菌。
4、直接將含凍存液的細(xì)胞培養(yǎng)板放入-80℃冰箱,冷凍保存。
二、凍存細(xì)胞復(fù)蘇方法
凍存管復(fù)蘇方式:
1、從冰箱取出凍存細(xì)胞管,立即放入37℃水浴槽中快速解凍。
2、待凍存的細(xì)胞懸液融化后,立即加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基于該冷凍管中與細(xì)胞混合,再將細(xì)胞混合液從凍存管中移入含有9 ml該細(xì)胞培養(yǎng)基的試管中,混合均勻。
3、離心收集培養(yǎng)細(xì)胞(參考離心條件:1,000~2,000 rpm,4℃,3~5 min),移去上清液。
4、清洗細(xì)胞,充分洗凈殘留凍存液。
5、加入適量新鮮培養(yǎng)基,使用移液管緩緩地均勻細(xì)胞混合液。適量地稀釋后,將細(xì)胞混合液移至事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中。
6、鏡檢后,研究者可根據(jù)各自方法和需要來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
原位復(fù)蘇方式:
1、從冰箱取出凍存培養(yǎng)板,立即放入37℃水浴槽中快速解凍。
2、待凍存的細(xì)胞懸液融化后,輕輕吸去細(xì)胞凍存液,按照常規(guī)換液操作加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。